Page 122 - 《应用声学》2020年第5期

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为了研究凝胶基质的刚性对声致穿孔诱导的质粒 持显著性差异。软的凝胶基质上的细胞保持圆形，
DNA 导入效果的影响，对细胞内的质粒 DNA 进行 细胞面积更小，硬的凝胶基质上培养的细胞延展性
示踪，采用 Cy3对质粒 DNA进行荧光标记。用Cy3 更好，细胞保持梭形状态，细胞表面积更大。由绿色
标记过的质粒DNA进行超声实验。超声激励前，采 荧光蛋白的表达情况来看，质粒 DNA 均可以成功
用 Hoechst 33342 对细胞核染色。超声激励结束后 导入进细胞并实现表达。
5 min，采用4%多聚甲醛室温下对细胞固定10 min。
磷酸盐缓冲液 (Phosphate buffer saline, PBS) 冲洗
2次。共聚焦显微镜三维层扫细胞内的质粒DNA分
布。层扫间距为1 µm。
采用 FITC标记的鬼笔环肽对细胞骨架蛋白进
50 µm 50 µm
行染色，对照组对分别培养在 0.2 kPa 和 40 kPa 硬
度的凝胶基底上的细胞进行固定染色。实验组选 (a) 0.2 kPa (b) 3 kPa
用声压为 0.45 MPa 的单脉冲串超声对分别培养在
0.2 kPa和40 kPa硬度的凝胶基底上的细胞进行超
声激励。超声脉冲串持续时间为 10 µs。超声激励
后 40 s 吸走培养皿内的 PBS 缓冲液，采用 4% 的多
聚甲醛溶液立即对超声激励后的细胞固定 10 min。 50 µm 50 µm
PBS 缓冲液冲洗 3 次，加入 FITC 标记的鬼笔环肽，
(c) 10 kPa (d) 20 kPa
终浓度为10 µg/mL。室温孵育40 min。PBS缓冲液
冲洗3次。滴加10 µL Hoechst 33342溶液进行细胞
核染色 10 min。共聚焦显微镜 (Olympus FV3000，
60倍油镜)三维扫描荧光成像。
每组实验至少重复 3 次。采用 Origin 8.5 软件
进行统计学分析，计量数据采用平均值 ± 均方 50 µm
根 (x ± m) 表示。采用单因素方差分析比较各实 (e) 40 kPa
验组结果存在的差异，以 p < 0.05 具有统计学
图 2 不同刚性凝胶基质上培养的细胞形貌
意义。
Fig. 2 Cell morphology cultured on hydrogel with
different rigidities
2 结果与分析
质粒 DNA 绿色荧光蛋白的表达效率 e 采用荧
2.1 基质刚性对质粒DNA转染效果的影响
光显微成像的方法收集数据，超声实验时对超声作
将 NIH 3T3 细胞分别培养在杨氏模量值为 用区域用马克笔进行标记。超声激励前后靶向微泡
0.2 kPa、3 kPa、10 kPa、20 kPa、40 kPa的凝胶基质
的响应采用倒置荧光显微镜进行记录。统计该视野
上，如图2所示，细胞培养在> 10 kPa的凝胶基质上
下微泡发生响应的细胞比例α。超声激励后24 h，对
时细胞形貌差别不大，细胞呈现出成纤维细胞梭形 超声激励区域用倒置荧光显微镜拍摄绿色荧光，计
形貌。而0.2 kPa 凝胶上的细胞形貌则呈现出圆形， 数超声激励区域表达绿色荧光的细胞数量 β，以及
与 40 kPa 凝胶上的细胞形貌差异很大。因此最终 同一视野下的细胞总数N。
选取了 0.2 kPa和40 kPa两个参数研究基质刚性对 α
e = . (1)
质粒 DNA 转染效果的影响。这两个弹性模量值也 N · β
是参考文献中研究基质刚性对细胞功能影响实验 如图 3(c) 所示， 在相同的超声条件激励下
中常见的具有代表性的数值 [7,18−19] 。 (0.45 MPa, 10 µs)，硬的凝胶基质上培养的成纤
如图 3(a)、图 3(b) 所示，不同刚性的凝胶基质 维细胞，绿色荧光蛋白的表达效率显著高于软的凝
上培养的细胞，在超声激励后24 h，细胞形貌仍然保 胶基质上培养的细胞。