Page 121 - 《应用声学》2020年第5期
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第 39 卷 第 5 期 荣宁等： 基质刚性影响声孔效应介导的单细胞基因转染 763
TEMED)、过硫酸铵(Ammonium persulfate, APS)
0 引言
以及交联剂 sulfo-SANPAH 等试剂，均购自 sigma
公司。力学信号敏感的小鼠成纤维细胞NIH 3T3采
作为一种非病毒式、非侵入性的方法，超声和
用 10% 胎牛血清 +90% 高糖 DMEM 以及 1% 双抗
靶向微泡结合在药物导入及基因治疗方面展现出
培养。选用 SIM4-5 超声微泡，购自 Advanced Mi-
巨大的应用潜能 [1−4] 。然而体外细胞培养环境与体
crobubbles laboratories LLC 公司。RGD 多肽用于
内环境差异巨大，导致体外研究成果难以直接应用
将微泡造影剂靶向连接在细胞膜表面。超声实验示
到临床治疗。近年来，越来越多的证据表明细胞生
意图如图1所示。
长环境的物理特性对细胞形貌以及功能具有显著
影响 [5−6] 。研究表明，单独调节细胞外基质刚性可
以实现对细胞迁移、增殖甚至分化等复杂过程的调
控 [7−8] 。研究表明，微泡对不同模式的超声激励产 ᡔܦ
生了不同程度的放大聚焦作用 [9−10] ，在超声激励
ॲจ
下微泡空化 [11] 会引发细胞膜周围的流体作用 [12] ， ᠏ዢDNA
RGDܳᐷ
进而影响细胞膜表面有小孔打开，使得药物和外
源基因得以进入细胞实现药物和基因的导入和治 ᢈᙬᄇ
டᐏᙬᄇ
疗。质粒 DNA 的转染过程是一个复杂的生物物理 ᳫᅌᙬᄇ
过程，该过程与微泡的空化以及细胞功能等密切相
图 1 质粒转染实验示意图
关 [13−14] 。体外细胞培养实验常用的培养皿材质通
Fig. 1 Schematic illustration of plasmid transfection
常为玻璃(弹性模量值为5.1∼11.9 GPa [15] ) 或塑料
(弹性模量值为 0.1 GPa [16] )，而在体组织的基质刚
1.2 实验方法
性范围则在 100 kPa 以内，脑组织的基质刚性甚至
凝胶基质制作参考文献 [17] 中的方法，通过
在1 kPa 以下 [7] 。体外细胞培养用的培养皿基质刚
调节丙烯酰胺单体和双体比例实现对凝胶基质刚
性比体内组织的刚性高出几个数量级，这就影响了
性的调节。制作硬度不同的凝胶基质，采用原子
体外细胞研究成果向临床治疗的转化。基质刚性如
力显微镜赫兹模型对凝胶基质的杨氏模量进行检
何影响质粒 DNA 的转染效果尚不清楚。本文旨在
测。最终用于实验的软的凝胶基质测得的杨氏模
探究细胞外基质刚性对质粒 DNA 转染效果的影响
量值为 (0.2±0.05) kPa，硬的凝胶基质杨氏模量为
及规律。制作不同刚性的凝胶基质进行基因转染
(40±1.2) kPa。I型胶原蛋白溶液稀释到50 µg/mL，
实验，获取到基质刚性对质粒转染效果的影响。并
滴加到用 Sulfo-SANPAH 活化过的凝胶基质上，室
对不同基质刚性上的转染实验进行质粒 DNA示踪，
温静置过夜，使胶原蛋白溶液充分吸附到凝胶基质
以期获取质粒在不同刚性基质上进入细胞方式的
表面。传代前向凝胶基质表面加入完全培养基室温
差异。进一步的细胞骨架蛋白分布从实验角度揭示
孵育30 min。将携带凝胶的玻璃底培养皿置于生物
产生转染效果差异的原因。
安全柜内紫外灭菌 0.5 h。将 NIH 3T3 传代到凝胶
4 2 ◦
1 实验材料及方法 基质上，细胞密度为 10 细胞/cm 。37 C、5% CO 2
培养箱内培养24 h，细胞融合度达到60%。
1.1 实验材料 选用携带增强型绿色荧光蛋白 (Green fluores-
为了制作不同硬度的凝胶基质，采用 3-氨基 cent protein, GFP)基因的质粒DNA进行基因转染
丙基三乙氧基硅烷 (3-Aminopropyltriethoxysilane, 实验。选择单脉冲串超声激励，声压在 0.45 MPa，
APES)、二氯二甲基硅烷 (Dichlorodimethylsilane, 超声持续 10 µs。质粒 DNA 浓度为 10 µg/ml。超
DCDMS)、25%(体积比) 戊二醛溶液、40%(质量体 声激励结束后将细胞更换新鲜的完全培养基，继
积比) 丙烯酰胺原液、2%(质量体积比) 双丙烯酰胺 续放回二氧化碳培养箱培养 24 h。倒置荧光显微
溶液、四甲基乙二胺 (Tetramethylethylenediamine, 镜观察绿色荧光蛋白表达情况，并计算转染效率。
